| NGS用PCR酶如何选择，优质文献为您解惑 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 下一代测序技术 (NGS) 的兴起对生命科学产生了深远的影响，目前已经被广泛应用于不同物种的科学研究中。PCR扩增是许多NGS文库构建的必要步骤。扩增单一靶标时，大部分PCR酶能够完成，但很少有PCR酶能够应对“NGS PCR”带来的挑战，即无偏差扩增不同大小和不同GC含量的靶标。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 2024年4月，英国剑桥大学医学院Wellcome Sanger研究所在《Microbial Genomics》期刊上发表了一篇名为《Identifying the best PCR enzyme for library amplification in NGS》的文章。文章中研究人员评测了市场上在售的20余种PCR酶，用于NGS文库构建，为短读长和长读长的NGS筛选出最适合的PCR聚合酶。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 测评结论： TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase（Code No.RR370）是短读长NGS文库扩增的优选酶之一 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix（Code No.639270）是长读长NGS文库扩增的优选酶之一 |
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| 接下来我们一起了解一下本篇文章的主要内容。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 为什么要谨慎选择用于NGS文库扩增的PCR酶？ | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 研究结果表明，在测序前，不同PCR酶在扩增效率和均一性上存在明显差异。进一步证实了PCR可能是引入基因组数据中偏差的来源。所以PCR酶的选择对于NGS文库扩增至关重要，特别是GC含量不均匀的模板，更加容易出现覆盖率偏差。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. 收量评价——降低循环圈数，降低偏差 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 被评价的PCR酶之间，其产量有比较大的差异。当使用低扩增效率的PCR酶时可能会带来较低的产量，反应过程则需要更多的PCR循环，结果的偏差会更突出。 使用TaKaRa Ex Premier扩增1 ng模板，进行 14个PCR循环后，结果的覆盖均一性与500 ng模板的PCR-Free文库的覆盖均一性接近，即使在GC含量比较极端的模板中也是如此。 值得注意的是本研究中测试的基因组之一，是疟原虫基因组（AT含量接近100%），因为感染者大多是年幼的儿童，只能采集到较少的血液样本，因此通常只能获得少量的DNA样本。利用TaKaRa Ex Premier，仅1 ng模板，就可以获得非常均匀的基因组覆盖。 |
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| 2. 低覆盖率指数评价——PCR酶的综合扩增能力 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 研究人员评价了不同PCR酶的低覆盖率指数（Low Coverage Index，LCI）。 LCI越低，说明NGS结果的覆盖率越高，测序深度越高。 有些PCR酶在特定基因组中表现较好，但TaKaRa Ex Premier在测评的所有基因组中，均表现了高覆盖率和良好的覆盖率均匀度。包括测试的百日咳杆菌、大肠杆菌、艰难梭菌、恶性疟原虫基因组以及人类基因组。 与PCR-Free方法构建的文库覆盖率相比，TaKaRa Ex Premier等三种PCR酶的偏差最小，覆盖率均匀度与PCR-Free方法构建的文库接近。 |
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| 3. 扩增准确性评价——PCR酶对SNP和indel的检测灵敏度 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 将NGS测序结果与参考基因组序列和突变序列列表进行比较，评价每个PCR酶的扩增准确性。 被评价的20余种PCR酶在微生物参考基因组中，SNP和indel检测灵敏度最高的是TaKaRa Ex Premier等三种PCR酶。 TaKaRa Ex Premie以非常高的重现性复制了很多SNP和 indel位点，SNP检测灵敏度达到了99.17%，indel检测灵敏度达到了93.85%。 |
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| 4. 人类基因组扩增评价——对庞大模板的扩增能力 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 人类基因组测序，特别是用于学术和临床结果的变异发现，是NGS的主要应用之一。人类基因组比微生物基因组要大得多，也更加复杂。TaKaRa Ex Premie的测试结果表现出色，覆盖范围均匀 (低LCI)，SNP和Indel检测灵敏度都比较高，优于被评价的大多数PCR酶。。 在本研究中，研究人员还筛选出 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix为长读长NGS文库构建的优选酶之一。 |
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| 另外，除了上述推荐的PCR酶外，Takara还有多款适用于NGS扩增的PCR酶产品供您选择! 例如在2014年，暨南大学和美国南加州大学的研究人员曾经在Scientific Reports（Nature）期刊上发表了一篇名为《Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer》的文章。文章中研究人员使用6种应用于长片段扩增的PCR酶，分别扩增12.9 kb、9.7 kb和5.8 kb的目的片段。结果发现只有PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以在相同的 PCR 反应条件下扩增出三个长度不同的靶标，而其余5种PCR酶均需要调整PCR反应条件才能够扩增出三个靶标，并且PrimeSTAR® GXL的性价比也较高。因此研究人员最终选择了PrimeSTAR® GXL进行后续的NGS实验。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在后续实验中，研究人员使用PrimeSTAR® GXL扩增了9名受试者的样本基因组并进行测序。最终发现，在相同的PCR反应条件下，PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以扩增绝大部分不同大小和Tm值的扩增子。这也再次证明Takara PCR酶在NGS领域具有出色的性能。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在未来，Takara Bio将持之以恒地运用生命科学领域的专业知识，不断创新，为科研工作者提供高质量、高性能的产品，共同开启生命科学研究的新篇章！ | ||||||||||||||||||||||||||||||||
√ 对于粗提样品、GC/AT rich、长链(～30 kb）等难扩增模板均可顺利扩增，具备高成功率 √ α型酶具有良好的校正功能，能保持高保真性 √ 预混型试剂，并且在-20℃保存不冻结，可节省操作时间 详细产品信息及实验例请点击链接查看：TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase |
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√ 高度敏感的DNA聚合酶，可直接使用动物或植物组织、粗提裂解液进行扩增 √ 对于难以扩增的模板（如GC含量大于70%）也能进行很好的扩增 详细产品信息及实验例请点击链接查看：Terra™ PCR Direct Polymerase Mix |
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√ 对于人类基因组DNA能够进行30 kb左右的长链扩增 √ 可对应GC rich，AT rich及高模板量，是一款兼具高通用性的高保真酶 详细产品信息及实验例请点击链接查看：PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase |
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| 【推荐用于NGS的PCR酶一览表】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
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页面更新：2024-07-15 11:19:39
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