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Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)
 
应用Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System，StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
 
请按照各种仪器使用说明书要求进行实验操作。
1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 使用量 使用量 终浓度
 Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） 10.0 μl   25.0 μl   1X  
 PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μl   1.0 μl   0.2 μM*1  
 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.4 μl   1.0 μl   0.2 μM*1  
 Probe 0.8 μl   2 μl   *2  
 ROX Reference Dye（50X）*3 0.4 μl   1.0 μl   1X  
 DNA模板 2.0 μl   4.0 μl   *4  
 dH2O（灭菌水） 6.0 μl   16.0 μl    
 Total 20.0 μl*5   50.0 μl*5    
*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 ROX Reference Dye的反应终浓度为1X。
*4 在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定理想的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*5 根据各仪器推荐反应体系进行调整。
 
2. 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件概述」。
< 7300 Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序：  
Stage 1：预变性  
Number of Cycles：1  
95℃  30秒  
Stage 2：PCR反应  
Number of Cycles：40  
95℃  5秒  
60℃  31秒*  
   
 
< StepOnePlus Real-Time PCR System >
Shuttle PCR标准操作流程  
Fast 模式  
Holding Stage  
Number of Cycles：1  
95℃  20秒  
Cycling Stage  
Number of Cycles：40  
95℃  1秒  
60℃  20秒  
 
 
◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
 
3. 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。