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| Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) |
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| 应用LightCycler/LightCycler 480 System的操作方法 |
| 请按照LightCycler/LightCycler 480（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作 |
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| 1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 |
| 试剂 |
使用量 |
终浓度 |
| Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） |
10.0 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.4 μl |
0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.4 μl |
0.2 μM*1 |
| Probe |
0.8 μl |
*2 |
| DNA模板 |
2.0 μl |
*3 |
| dH2O（灭菌水） |
6.4 μl |
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| Total |
20.0 μl |
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*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA (RT反应液) 为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
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| 2. 进行Real Time PCR反应。 |
| PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件概述」。 |
| ＜LightCycler＞ |
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| 两步法PCR扩增标准程序： |
| Stage 1：预变性 |
| 95℃ 30秒 20℃/秒 |
| 1 Cycle |
| Stage 2：PCR反应 |
| 95℃ 5秒 20℃/秒 |
| 60℃ 20秒 20℃/秒 |
| 40 Cycles |
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| ＜LightCycler 480 System＞ |
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| 两步法PCR扩增标准程序： |
| Denature |
| 95℃ 30秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec) |
| 1 Cycle |
| PCR |
| Analysis Mode: Quantification |
| 95℃ 5秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec) |
| 60℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec, Acquisition Mode : Single) |
| Cooling Cycle |
| Cooling |
| 50℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec) |
| 1 Cycle |
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◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
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| 3. 实验结果分析。 |
| 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。 |
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