TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) |
实验条件的选择 |
如果按照推荐的两步法条件进行反应,反应性能不好时,请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。另外,根据反应情况选择特异性不同的Perfect Real Time系列试剂(Code No. RR420Q/A/B, RR430 S/A/B, RR091A/B),可提高PCR反应性能。 |
实验条件选择时,请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系,并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。 |
○ 反应特异性高的实验体系应具备以下条件: |
· No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。 · 不产生目的片段以外的扩增。 |
○ 扩增效率高的实验体系应具备以下条件: |
· 扩增产物起峰更早(Ct值小)。 · PCR扩增效率高(接近理论值100%)。 |
1. Primer浓度与反应性能间的关系如下: |
降低Primer浓度有助于提高特异性;提高Primer浓度有助于提高扩增效率。图示如下: |
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2. PCR条件与反应性能间的关系如下: |
① 要提高反应特异性,可以提高退火温度。 |
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② 要提高扩增效率,可以增加延伸时间或变为3 Step PCR反应。 |
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③ 预变性。 预变性条件通常设定为95℃ 30 sec,使用此条件对于难变性的环状质粒DNA和基因组DNA模板基本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件,可以延长至1~2分钟。但是时间过长酶容易失活,不推荐使用2分钟以上的变性条件。 |
3. 各种试剂与反应性能间的关系如下: |
Takara Bio提供几种不同的TB Green嵌合法real-time PCR试剂,这些试剂的反应特异性以及扩增效率间有以下关系。TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(Code No. RR420Q/A/B)和TB Green Fast qPCR Mix (Code No. RR430A/B)是扩增效率与反应特异性综合性较好、通用性高的试剂,但是,如果想提高反应特异性,使用TB Green Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)(Code No. RR091A/B)和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)则更有效。 |
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