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RNAiso Plus
鸡软骨及骨组织中的RNA提取
 
[使用试剂]
          RNAiso Plus（Code No. 9108）
          High-Salt Solution for Precipitation (Plant)（Code No. 9193）
 
[检测样品]
          鸡软骨组织 200 mg
          鸡骨组织   200 mg
 
[方法]
          1. RNA提取
  · 将200mg鸡软骨组织和骨组织移至乳钵中，边加液氮边研磨至粉末。
  · 液氮挥发后，加入4ml RNAiso Plus，再次进行匀浆后按照RNAiso Plus的操作流程进行了RNA提取。但是在异丙醇沉淀时，加入0.25倍RNAiso Plus体积量的High-Salt Solution for Precipitation (Plant)混合，再加入0.25倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，混合后再按照RNAiso Plus的操作流程回收了total RNA。最后溶解于30 μl RNase-free water。
  · 与没有添加High-Salt Solution for Precipitation (Plant)的相同检测样品按照RNAiso Plus的操作流程回收的total RNA进行了比较。
          2. RT-PCR
  · 使用1提取的RNA对β-actin进行了RT-PCR。使用扩增mRNA来源和基因组DNA来源DNA时扩增片段大小不同的引物，对混入的基因组DNA进行了确认。
 
[结果]
          1. 提取RNA的电泳结果
             ＜软骨组织＞
Lane： 提取方法
1、2：   RNAiso Plus
3、4：   RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)
 
             ＜骨组织＞
Lane： 提取方法
1、2：   RNAiso Plus
3、4：   RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)
Total RNA 5 μl Apply  
1% Agarose  
M： DL2,000 DNA Marker  
 
          2. 提取RNA的收量和纯度
             ＜软骨组织＞
检测样品No. 提取方法 提取量
（μl）		 A260 A280 A260/A230 A260/A280 RNA量*1
（μg/100 mg组织）
1 RNAiso Plus 30 66.36 44.60 1.06 1.49 79.63*2
2 RNAiso Plus 30 85.77 51.31 0.99 1.67 102.92*2
3 RNAiso Plus＋High-Salt 30 4.56 2.43 2.43 1.88 5.47
4 RNAiso Plus＋High-Salt 30 5.66 2.90 1.66 1.95 6.79
 
             ＜骨组织＞
检测样品 No. 提取方法 提取量
（μl）		 A260 A280 A260/A230 A260/A280 RNA量*1
（μg/100 mg组织）
1 RNAiso Plus 30 83.00 49.15 0.99 1.67 99.61*2
2 RNAiso Plus 30 80.46 57.75 0.91 1.39 96.55*2
3 RNAiso Plus＋High-Salt 30 4.56 2.55 1.75 1.97 6.01
4 RNAiso Plus＋High-Salt 30 5.66 3.28 2.08 1.98 7.79
 
              *1 RNA量：利用A260计算出的值
              *2 仅使用RNAiso Plus提取的检测样品中因含有大量的多糖等杂质， 认为A260的测定值没有反映出准确的RNA量。
 
          3. 提取的RNA进行了RT-PCR反应
 
RNA Sample： 各500 ng
RT Primer： Oligo dT Primer
反转录酶： Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)（Code No. 2641）
PCR酶： TaKaRa LA Taq（Code No.RR002A）
反转录反应： 10 μl
PCR反应体系： 50 μl（使用2 μl反转录反应液）
Target： β-actin
mRNA来源的扩增片段大小： 561bp
genome DNA来源的扩增片段大?。?/span> 561bp
PCR 条件： 98℃  30 sec. 30 cycles
  55℃  10 sec.
  72℃  1 min.
 
             ＜骨组织＞
Lane： 提取方法
1：   RNAiso Plus
2：   RNAiso Plus                       [RTase（－）]
3：   RNAiso Plus＋High-Salt
4：   RNAiso Plus＋High-Salt            [RTase（－）]
PCR反应液 10μl上样  
3% Agarose  
M：100 bp DNA Ladder  
 
 
 
［总结］
  · 使用RNAiso Plus从骨和软骨中提取RNA过程中，在异丙醇沉淀沈时加入High-Salt Solution for Precipitation (Plant)后回收RNA、可制备A260/A280比值高于1.8的高纯度total RNA。软骨来源RNA进行凝胶电泳时还可确认到核糖体RNA片段。
  · 从RT-PCR的结果可以看出，从软骨中提取RNA时，仅使用RNAiso Plus 提取的RNA有微弱的扩增产物，而使用High-Salt Solution for Precipitation (Plant)提取的RNA，软骨来源和骨来源均可获得清晰的扩增产物。此外，二者在RTase（－）的扩增结果中没有确认到基因组来源的扩增产物。
  · 一般从骨和软骨组织中很难提取RNA，但使用RNAiso Plus提取RNA时与High-Salt Solution for Precipitation (Plant)并用可获得如本实验所示的高纯度RNA。