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Protocols
MightyAmp™ Genotyping Kit操作流程（Code No. R074A）
 
A．从组织材料中提取DNA（在室温下操作）
1. 将组织材料*1放入已加入100 μl Extraction Buffer的PCR Tube中。
   【注意】Extraction Buffer出现沉淀时，加热至60℃，缓慢搅拌溶解。
2. 将1 μl Proteinase K (20 mg/ml)加入到Tube中。
3. 60℃加热5分钟后，98℃再加热2分钟，然后降至室温*2。
4. 室温下离心，使组织材料沉淀，上清为PCR的模板（Extraction Buffer提取液）*3。
   *1：组织材料的添加标准
   · 小鼠尾≤2 mm
   · 小鼠耳≤5 mm2
   · 小鼠脏器≤30 mm3
   · 植物的叶≤5 mm2
   *2：4℃时会产生沉淀物，操作中请保持室温(25℃)。
   *2：需要保存时，将上清移至新的Tube中于-20℃保存。
       使用前请将Extraction Buffer提取液溶解至室温，确认溶液中无沉淀物。
 
B．PCR反应液配制（50 μl反应量）
试剂 使用量 终浓度
  2×MightyAmp Buffer 25 μl 1×
  Primer 1 15 pmol 0.3 μM
  Primer 2 15 pmol 0.3 μM
  Extraction Buffer提取液* ≦ 2.5 μl  
  MightyAmp DNA Polymerase 1 μl 1.25 U/50 μl
  灭菌水 Up to 50 μl
 
* Extraction Buffer提取液必须达到室温后再使用。建议Extraction Buffer提取液的添加量在反应体系的1/20以下。其他试剂使用前请置于冰上。
 
C．PCR反应条件设定
标准反应条件为3 Step PCR，延伸温度设定为68℃。
[3 Step PCR]  
                      98℃ 2 min*  
                       ↓
98℃ 10 sec.   30～40 cycles
60℃ 15 sec.  
68℃ 1 min/kb  
 
or  
[2 Step PCR]  
                      98℃ 2 min*  
                       ↓
98℃ 10 sec.   30～40 cycles
68℃ 1 min/kb  
 
 
* 使用了抗性非常强的Hot Start酶，在初期变性时必须进行98℃ 2 min.的抗体变性步骤。
 
D．PCR扩增产物的电泳
· 电泳前将5 × Loading Dye和PCR产物按照1：4比例混合。
· 使用MightyAmp DNA Polymerase扩增得到的PCR产物，电泳时请尽量使用TAE Buffer，使用TBE Buffer有时得不到好的电泳结果。