附近一百元三个小时_上门服务24小时接单平台,附近约一泡50元,500元快餐4小时不限次数

Control反应的扩增
(TaKaRa LA PCR™ Kit Ver.2.1)
 
Control反应
 
A. LA 篇
 
本试剂盒作为control包含HT29来源的基因组DNA及扩增约17.5kb区域所需的引物。
 
1. 按下述所示制备反应液。
    反应液量   终浓度
  10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl ［1×］
  dNTP Mixture 8 μl 各400 μM
  Control Primer LA3 1 μl 0.2 μM
  Control Primer LA4 1 μl 0.2 μM
  TaKaRa LA Taq 0.5 μl 2.5 U/50 μl
  Control Template 2 μl 200 ng/50 μl
  灭菌水 32.5 μl  
  Total 50 μl  
 
2. 为防止样品蒸发、使用50 μl矿物油*或Ampli Wax PCR Gem**1个覆盖反应液。（使用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP 或PERSONAL时不需要）
* 反应结束后如需完全去除矿物油，使用100 μl氯仿进行抽提。
** 如果使用Ampli Wax PCR Gem，不需要进行氯仿抽提。另外，Hot Start法可以自动化。
 
3. 将反应管置于Thermal Cycler中。
 
4. 按以下条件进行PCR反应。
98℃ 20 sec.*   30 cycles
68℃ 15 min.
* 如果使用的是TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，PERSONAL按照下述条件进行PCR反应。
 
不需要使用矿物油和PCR用Wax。
98℃ 10 sec.   30 cycles
68℃ 15 min.
 
5.反应结束后、取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。使用Control Primer LA时，能确认得到约17.5 kb的条带。
 
B. GC rich篇
 
本试剂盒作为Control，包含HT29来源的基因组DNA以及扩增约1,255 bp区域（GC含量65％）所需的引物。
 
1. 按下述所示制备反应液。
    反应液量   终浓度
  2×GC Buffer I或2×GC Buffer II 25 μl ［1×］
  dNTP Mixture 8 μl 各400 μM
  Control Primer GC1 1 μl 0.2 μM
  Control Primer GC2 1 μl 0.2 μM
  TaKaRa LA Taq 0.5 μl 2.5 U/50 μl
  Control Template 1 μl 100 ng/50 μl
  灭菌水 13.5 μl  
  Total 50 μl  
 
2. 同A.LA篇
 
3. 同A.LA篇
 
4. 按以下条件进行PCR反应。
（Thermal Cycler TP2000、TP480、MP、PERSONAL等）
94℃ 1 min  
94℃ 30 sec.   30 cycles
60℃ 30 sec.
72℃ 2 min.
72℃ 5 min.  
 
5.反应结束后、取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。使用Control Primer GC时，能够确认得到1,255 bp的条带。
 
操作注意
· 推荐DNA使用量
人基因组DNA 0.1 μg～1 μg/50 μl PCR
大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ng/50 μl PCR
λ噬菌体DNA 0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR
 

·扩增长链DNA时的反应液体积，建议为10～50 μl。反应液体积大于50 μl时，可能会降低扩增效率。
·扩增长链DNA时用的引物，需设计为高特异性引物。为提高特异性，引物为30～35 mer时效果较好。
·模板DNA尽量使用纯度较高的样品。此外，扩增长链DNA时的模板DNA量，通常为一般PCR时的4～5倍量。
·试剂盒中的试剂恢复至室温～37℃并完全溶解后，使用移液器或将反应管上下颠倒使其充分混匀。请尽量避免vortex?；煸?0×LA PCR Buffer（以及2×GC Buffer）、TaKaRa LA Taq时，操作时请注意不要产生气泡以避免引起酶失活。另外，试剂盒中各试剂至使用前于冰上保存。

·反应开始前，轻轻吸打混匀反应液。此时，注意一定不要使用vortex。
·如果样品DNA有蛋白酶污染，先进行热变性操作（denaturation step），之后加入TaKaRa LA Taq。通过热失活蛋白酶能够防止TaKaRa LA Taq的降解。