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PrimeScript™High Fidelity RT-PCR Kit的操作方法
 
A. 模板RNA的变性及反转录反应
A-1. 按下述所示制备反应液
 
试剂 使用量
dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl
Oligo dT Primer (2.5 μM)  
  or Random 6 mers(20 μM) 1 μl
  or Specific Primer (2 μM)*1
Template RNA*2  
  or Positive Control RNA ［4×105 copies］
RNase Free dH2O up to 10 μl
   
*1 合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任选一种。
*2 Template RNA最多可加至8 μl，当使用Total RNA时，最多可加至3 μg（推荐使用量：100 ng～1 μg）。
 
A-2. 制备后的反应管置于Thermal Cycler中，按下述程序进行变性，退火。
              65℃ 5 min.  
              4℃  
 
＜重要＞通过上述变性?退火操作，反转录引物能够特异性的与模板RNA退火，提高反转录效率。
 
A-3. 变性·退火后的反应液添加以下试剂。
 
试剂 使用量
A-2 的变性·退火后的反应液 10 μl
5×PrimeScript Buffer 4 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl
PrimeScript RTase 0.5 μl
RNase Free dH2O 5 μl
  20 μl
 
A-4. 反应管置于Thermal Cycler中，按照下述程序进行反转录反应。
              (30℃                   10 min.)*3  
              42℃ （～ 50）℃     15～30 min.  
              95℃                    5 min.*4  
              4℃  
 
*3 反转录反应使用Random 6 mers时，进行此操作可使Random 6 mers与模板RNA在42℃（～50℃）充分退火延伸，从而提高反转录效率。
*4 进行长片段DNA 扩增时，为了避免破损1st cDNA 链，可70℃反应15 min进行失活操作。
 
＜重要＞
对于高级结构，PrimeScript RTase具有很强的延伸性能，通常反应在42℃进行。使用特异性的下游PCR引物进行反转录时，会出现由于引物错配导致的非特异性扩增产物。此时，可以通过将反应温度设置为50℃进行改善。
 
B. PCR反应
 
B-1. 按下述所示制备反应液
 
试剂 使用量 终浓度
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25 μl 1×
上游Primer（20 μM）*5（sense） 0.5 μl 0.2 μM
下游Primer（20 μM）*6（antisense） 0.5 μl 0.2 μM
A-4 中的反转录反应液 ≤5 μl
灭菌水 up to 50 μl
 
*5 Positive Control RNA时，使用F-1 Primer
*6 Positive Control RNA时，使用R-1 Primer
 
B-2. 制备后的反应管放于Thermal Cycler中，以适宜条件进行PCR。
 
一般PCR反应条件     Positive Control RNA的反应条件*7    
98℃ 10 sec.   30 cycles 98℃ 10sec.   30 cycles
55℃ 5 or15 sec.   55℃ 5 sec.  
72℃ 1 min./kb   72℃ 30 sec.      
 
*7 反转录反应使用Oligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primer中的任意引物，使用Control Primer F-1与R-1进行PCR，得到462 bp的扩增产物