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标准操作流程
BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver.1.1
 
■ 操作流程
 
A. 反转录反应
1. 按下表所示制备反应液。
 
试剂 使用量 终浓度
 MgSO4 (25 mM) 2 μl 5 mM
 2×Bca 1st Buffer 5 μl 1 ×
 RNase Free dH2O 0.75 μl  
 dNTP Mixture（各10 mM） 0.5 μl 0.5 mM
 RNase Inhibitor 0.25 μl 1 U/μl
 BcaBEST polymerase(22 U/μl) 0.5 μl 1.1 U/μl
 Random 9 mers
         or
 Oligo dT Primer
         or
 特异性下游PCR Primer
 (R-1 Primer) 		0.5 μl 2.5 μM
or
0.125 μM
or
1 μM
 Positive Control RNA
         or
 实验样品 RNA 		0.5 μl ［1 ×105 copies］
or
［≤500 ng total RNA］
 Total 10 μl/sample  
 
* 实验样品是表达量低的RNA时，样品体积可增至1.25 μl。
 
2. A. -1中反应液充分混合后，加入矿物油覆盖。
（使用TaKaRa Thermal Cycler Dice、GP、SP、MP、PERSONAL时不需要添加）
反应用引物可以使用Random 9 mers、Oligo dT Primer、特异性下游PCR引物（Positive control RNA时使用Control R-1 Primer ）中任意一个。
 
制备完成的反应管置于Thermal Cycler中，按下述程序进行反应。
 
 
B. PCR反应
1. 按下表所示制备反应液。
 
试剂 使用量 终浓度
 MgSO4 (25 mM) 3 μl 2.5 mM
 5 × Bca 2nd Buffer 8 μl 1 ×
 Bca-Optimized Taq 0.25 μl 12.5 U/50 μl
 上游PCR引物（20 μM）
（Control RNA使用F-1 Primer）		 0.5 μl 0.2 μM

 下游PCR引物（20 μM）
 (Control RNA时使用R-1 Primer)

0.5 μl 0.2 μM
 灭菌水 27.75 μl  
 Total 40 μl/sample  
 
1'. 按上述条件反应进行扩增时如未得到扩增产物，可以尝试使用以下的反应组成，可以改善条件。
 
试剂 使用量 终浓度
 MgSO4 (25 mM) 3 μl 2.5 mM
 2 × Bca 1st Buffer 20 μl 1 ×
 Bca-Optimized Taq 0.25 μl 12.5 U/50 μl
 上游PCR引物（20 μM） 0.5 μl 0.2 μM

 下游PCR引物（20 μM）

0.5 μl 0.2 μM
 灭菌水 15.75 μl  
 Total 40 μl/sample  
 
2. 取1.的反应液40 μl加入到A-2.反转录结束的反应管中。
3. 轻微离心约10秒钟。
4. 制备好后的反应管置于Thermal Cycler中，使用合适的程序进行扩增。
 
常用的反应条件
 
 94℃  30 sec 25～30 cycles
 37～65℃  30 sec
 72℃  1～10 min
 72℃  5 min  
 
Positive Control RNA反应条件
 
 94℃  30 sec 28 cycles
 60℃  30 sec
 72℃  1 min
 
5. 反应结束后，取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。
PCR反应产物至分析使用前冷冻保存。
 
■ Positive Control RNA的扩增产物大小
 
反转录反应用引物 PCR primers 扩增片段
 Oligo dT Primer

Control F-1Primer
&
Control R-1 Primer

 462 bp
 Random 9 mers
 R-1 Primer