| PrimeDirect® Probe RT-qPCR Mix, with UNG实验例 | ||||||||||||||||||||
| 本制品无需进行RNA纯化，可直接以培养细胞或活体材料起始进行Real Time PCR。以下主要介绍使用培养细胞及病毒、细菌、血液、尿液等样品起始的实验例。 | ||||||||||||||||||||
| 1. K562细胞 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 使用PBS将K562细胞悬液分别按照1×103～105 cells/μl比例稀释后，各使用1 μl 引物／探针检出范围： WT1基因（Cy5标记）／GAPDH基因（FAM标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的试剂按照各公司推荐的protocol制备反应液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec |  |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| * 其他公司试剂的反转录反应时间，按照各公司推荐的30 min和PrimeDirect Mix相同的5 min分别进行了两个反应。其他按照各公司protocol推荐的条件进行。 | ||||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| 使用1×103～105 个K562细胞，进行WT1基因（白血病标志）及GAPDH基因（管家基因）的表达分析。反转录反应5 min的条件下，PrimeDirect Mix具有比其他公司试剂更高的灵敏度检出上述基因。另外，相比于其他试剂推荐的30 min的反转录反应时间，PrimeDirect Mix显示具有与其他公司同等或高于其他公司试剂的灵敏度。 | ||||||||||||||||||||
| WT1基因 | ||||||||||||||||||||
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| GAPDH基因 | ||||||||||||||||||||
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| Takara Bio Inc.比较结果 | ||||||||||||||||||||
| 2. 金黄葡萄球菌 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 金黄葡萄球菌悬液经PBS分别稀释为1×101～103 cfu/μl，各使用1μl 引物／探针检出范围： 16S rRNA基因（Cy5标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的试剂按照各公司推荐的protocol制备反应液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 反应条件1（No RT） | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 反应条件2（RT 5min） | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| * 其他试剂按照各公司Protocol推荐的反应条件进行反应。 | ||||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix能够稳定检出10 cfu金黄葡萄球菌。此外，与以基因组DNA起始按照反应条件1 (No RT) 反应相比，以RNA起始按照反应条件2（RT 5min）进行反转录反应的实验显示出更高的检出灵敏度。与其他试剂相比，PrimeDirect Mix在反转录反应为5 min的条件下，显示比其他反转录反应30 min的检出灵敏度高。 | ||||||||||||||||||||
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| Takara Bio Inc.比较结果 | ||||||||||||||||||||
| 3. 全血中的金黄葡萄球菌 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（肝素血及EDTA血）及其10倍稀释液（PBS）中加入1×101～105 cfu/μl浓度的金黄葡萄球菌，制备好后各使用1μl 引物／探针检出范围： 16S rRNA基因（Cy5标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| * 其他公司的试剂按照各公司推荐的protocol制备反应液。 | ||||||||||||||||||||
| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 60℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 60℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| 虽然使用血液成分进行检出时有阻害，但是PrimeDirect Mix在全血原液中（肝素血、EDTA血）可直接检出100 cfu，其10倍稀释液也可以直接检出10 cfu的金黄葡萄球菌。该实验显示，1 μl全血中如果存在100 cfu的金黄葡萄球菌，可以检出。 | ||||||||||||||||||||
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| 4. a. 尿液中的Zika病毒 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 在尿液及其10倍稀释液（生理盐水）中，加入2×103 copies/μl浓度的NATtrol Zika Virus（ZeptoMetrix公司）制备起始样品，然后各使用1 μl 引物／探针检出范围： Polyprotein基因（ROX标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害，可直接检出尿液中的Zika病毒。 | ||||||||||||||||||||
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| b. 尿液中的Zika病毒（检出灵敏度） | ||||||||||||||||||||
| 材料： 尿原液中分别添加浓度为2×10-2～103 copies/μl NATtrol Zika Virus制备起始样品，各使用1 μl 引物／探针检出范围： Polyprotein基因（ROX标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| PrimeDirect Mix不易受尿液阻害，尿液中的Zika病毒2个拷贝以上即可检出。感染者的尿液中该病毒RNA浓度为2.1 x 10 copies/μl的案例也有报道，使用本试剂能够满足检出灵敏度。 Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA浓度的案例：2.1 x 10 copies/μl (https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html) |
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| 5. a. 全血中的Zika病毒 | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（EDTA血）及其10倍稀释液（生理盐水），以2×103 copies/μl 的浓度添加NATtrol Zika Virus 制备起始样品，各使用1 μl 引物／探针检出范围： 引物/探针检出范围：Polyprotein基因（ROX标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| 全血原液（EDTA血）有检出阻害，直接检出Zika病毒很困难，但是用10倍稀释液可以检出。 | ||||||||||||||||||||
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| b. 全血中的Zika病毒（检出灵敏度） | ||||||||||||||||||||
| 材料： 全血（EDTA血）10倍稀释液（生理盐水），以2×10-2～103copies/μl 的浓度加入NATtrol Zika Virus制备起始样品，各使用1 μl 引物／探针检出范围： 引物/探针检出范围：Polyprotein基因（ROX标记） |
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| Real Time PCR反应液的制备 | ||||||||||||||||||||
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| Real Time RT-PCR反应 | ||||||||||||||||||||
| 90℃ | 3 min | |||||||||||||||||||
| 56℃ | 5 min | |||||||||||||||||||
| 95℃ | 5 sec | |
40 Cycles | |||||||||||||||||
| 56℃ | 30 sec | |||||||||||||||||||
| 结论： | ||||||||||||||||||||
| 血液成分对检出虽然有阻害作用，但全血10倍稀释液中的Zika病毒2拷贝以上可以检出。显示出在全血原液1 μl中存在20拷贝左右的Zika病毒时，可以检出。 | ||||||||||||||||||||
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| 制品信息 | ||||||||||||||||||||
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京公网安备 110114000405号